BGISEQ外显子助力恶性卵巢癌多组学研究文章发表

高级浆液性卵巢癌（HG-SOC）是常见的上皮性卵巢癌，也是最致命的卵巢癌之一。这种类型的卵巢癌患者，确诊后的5年存活率只有30%。但由于缺乏临床应用（从诊断到患者生存率预后）的生物标志物，我们对HG-SOC仍然知之甚少。

为更深入探索其表观调控与临床现象间的具体机制，研究者以HG-SOC对顺铂耐药为研究对象，使用多组学方法（ChIP-Seq、RNA-Seq和WES）为组蛋白甲基化和表观调控提供了新的研究典范，相关研究成果已发表在国际顶级学术期刊《Nature Communications》。

本文数据显示，BGISEQ外显子可以很好地识别单核苷酸突变和小的插入缺失。BGISEQ结合WES测序技术（外显子区域仅占全基因组＜2%比例，却包含了85%的致病突变）将最经济、高效地用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得变异与疾病的关系。

文章对20例高级别浆液卵巢癌（HG-SOC）和20例良性疾病患者（10例子宫肌瘤和10例子宫腺瘤）进行外显子测序。文库打断成150-250bp，使用BGISEQ外显子，通过BWA比对软件和GATK的HaplotypeCaller分别进行序列比对和变异检测。全外显子测序证实在HG-SOC中，超过95%的病例发生了TP53的突变。和对照的样品相比，HG-SOC样本的差异表达的基因显著富集在TP53相关信号通路上。

表1 高通量测序研究的病人特征

文献解读

发表时间：2018年4月30日

发表期刊：Nature Communications

影响因子：12.12

发表单位：华中科技大学同济医学院

文章摘要：化疗耐药是卵巢癌治疗的主要临床障碍。表观遗传学在调节恶性表型中起着关键性的作用，并有潜力开发治疗有价值的靶点，以改善这种疾病的不良后果。文章表明，一系列的转录因子，包括C/EBPβ、GCM1和GATA1可作为肿瘤细胞中组蛋白甲基化的潜在调节剂。

值得注意的是，C/EBPβ是卵巢癌患者的独立预后因子，它介导了一种重要的机制，通过这种机制，表观遗传学酶以相关的方式修饰功能相关基因组。通过甲基转移酶DOT1L、C/EBPβ可通过多个耐药基因的H3K79甲基化维持开放的染色质状态，从而增强肿瘤细胞的化疗耐药性。该论文提出了一种抗癌表观遗传学的新途径，其中鉴定和靶向表观遗传学关键调节因子如C/EBPβ可能为卵巢癌提供更精确的治疗选择。

组蛋白甲基化，

发现关键基因C/EBPβ

在HG-SOC组织中，研究人员应用ChIP-Seq技术对H3K4、H3K36、H3K79（转录激活相关）和H3K9、H3K27、H4K20（转录抑制相关）六个甲基化位点进行基因层面的分析，结果显示HG-SOC中许多基因的H3K79甲基化上调，并在IHC实验中得到证实。RNA-Seq结果表明HG-SOC中上调的基因与H3K79高甲基化相关，说明H3K79甲基化对于调控基因表达发挥重要作用。

使用癌症基因组图谱（TCGA）数据集分析转录因子的下游基因，证明CEBPB不仅调节许多基因的表达，而且调节HG-SOC中超过三分之一的H3K79相关上调基因的表达。接着，利用生信软件HOMER，研究人员找到与组蛋白甲基化相关的35个转录因子(TF)，其中CEBPB（编码C/EBPβ蛋白）与H3K79甲基化上调成最显著相关性。（见图1）

图1 HG-SOC表观遗传重编程转录因子

C/EBPβ高表达

促进卵巢癌对顺铂耐药

卵巢癌患者在临床治疗中遇到的主要障碍是耐药性，导致患者预后较差。而C/EBPβ在不良预后病人中高表达，研究人员推测C/EBPβ与卵巢癌对顺铂耐药相关。

利用TCGA数据库和IHC实验，对C/EBPβ和卵巢癌病人的顺铂耐药可能性进行评估，结果显示高表达的C/EBPβ与顺铂耐药正相关。应用C/EBPβ基因过表达和敲降技术，在细胞实验和动物实验同步证实：C/EBPβ过表达促进顺铂耐药，而敲降C/EBPβ可以降低顺铂耐药。此外，临床卵巢癌患者在顺铂治疗后，肿瘤组织中的C/EBPβ蛋白表达水平也有明显上调。（见图2）

图2  C/EBPβ与顺铂抗性分析

C/EBPβ重新编程H3K79甲基化

ChIP-Seq实验结果显示，在两种不同的卵巢癌细胞系，敲降C/EBPβ可以导致H3K79甲基化水平下调，进而导致H3K79调控基因表达下调。RNA-Seq分析发现C/EBPβ敲降后，1238个基因发生上调，504个基因发生下调，其中9个与顺铂抗性相关基因的表达水平伴随着H3K79甲基化的下调而降低。IPA分析显示这些基因主要参与到顺铂抗性相关的DNA损失修复（DDR）信号和ERK5信号中。（见图3）

图3  C/EBPβ调节H3K79甲基化重编程基因表达

发现C/EBPβ调控

H3K79甲基转移酶DOT1L

ChIP-Seq实验结果显示，C/EBPβ靶向基因与DOT1L靶向基因具有显著相关性，并且C/EBPβ结合位点与DOT1L结合位点距离接近，两者有物理相互作用。经过ChIP-qPCR验证结果进一步证实，C/EBPβ通过增强DOT1L结合能力调节H3K79甲基化。应用DOT1L抑制剂或shRNA进行体内外抑制实验，发现DOT1L抑制后，C/EBPβ高表达引起的顺铂耐药性也随之降低。（见图4）

图4  C/EBPβ通过DOT1L调节H3K79甲基化

小结

该文章采用经典的甲基化研究思路，找到甲基转移酶复合物C/EBPβ-DOT1L在卵巢癌顺铂耐药中发挥作用，通过DNA测序、RNA测序和表观学结合的方法揭开了表观调控与肿瘤耐药之间关系，明确耐药机制，为甲基化调控深入研究提供了典范。

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关于BGISEQ外显子

1. 下机数据质量高

下图为碱基分布平衡情况。从图中可以看到碱基分布平衡性好，N序列也很少。

图5 BGISEQ外显子测序碱基分布

Q值反映平台的测序准确性，数据质量是后续分析的基础。下图共统计了144个最新的商业样品的数据，其中Q20平均97%，Q30平均89%。

图6 BGISEQ外显子下机数据质量统计

2. 比对率高，覆盖度均一

国际标准品NA12878和商业样品的数据同时显示BGISEQ外显子捕获特异性（Capture specificity）好、PCR-duplication低、覆盖很均一。如下表显示，平均测序深度120X时，20X以上的覆盖度＞97%。

表2 BGISEQ-500外显子比对统计情况

3. 与H测序平台一致性高，平台自身稳定性好

BGISEQ平台和H测序平台一致性和特异性比较结果。从下图中我们可以清晰地看到，两个平台的SNP一致性高达97%，InDel一致性高达81%。BGISEQ自身SNP的重复性高达98%，InDel重复性高达85%，处于国际领先水平。表明该平台测序结果稳定、可靠。

图7 与H测序平台的一致性比较

4. 变异检测准确度和灵敏性高

对NA12878使用GIAB公布的标准集进行精确度和灵敏度的评估，发现在高置信变异区间，BGISEQ灵敏度与H测序平台表现相当，甚至优于后者。目标区域内，BGISEQ的SNP精确度表现更好。

图8 BGISEQ外显子SNP检测的精确度和灵敏度表现

关于BGISEQ测序平台

BGISEQ测序平台是华大基因自主研发的首款桌面型高通量测序系统，采用先进的联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术，提供一站式、开放性的基因测序全面解决方案。具备精准、简易、快速、灵活、可拓展等优点，既能充分适用临床检测，也能满足更广泛的科研需求。现在BGISEQ平台已经广泛用于DNA、RNA测序方向，相关文章已经发表40余篇， 包括《Cell》、《Nature Neuroscience》、《The Journal of Clinical Investigation》、《PNAS》等杂志，累计影响因子262。

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撰稿：敏   敏

编辑：市场部

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